产品描述

TUNEL(TdT mediated  dUTP Nick End Labeling) 技术可对组织或细胞中凋亡小体或单个凋亡细胞进行染色，能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。凋亡细胞内的内源性核酸内切酶被激活而将自身染色体DNA 切断成产生大量的3-OH 末端片段，利用这一特点，用脱氧核苷酸末端转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Trans-ferase,TdT)  将标有标记物 (dUTP-488)  的脱氧核苷酸转移到3-OH 末端，从而将凋亡信号标记出来。

储存与运输

 冰袋 (wetice)    运输；本试剂盒储存在-20℃,有效期12个月。

试剂组成

样品准备

A.石蜡包埋组织切片

1. 室温下将组织石蜡切片放入二甲苯中浸泡5-10min, 重复2-3次；然后无水乙醇 浸泡5min,    重复2次；最后用梯度乙醇(85%、75%、双蒸水)各浸泡1次，每次 5min;

   
   

2. 用PBS轻轻润洗切片，并去掉样本周围多余液体；使用组化笔沿组织外围轮廓画 一个与组织间隔2-3mm   的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

3. 配制 Proteinase      K工作液：按1:99的比例，用PBS 作为稀释液来稀释Proteinase K作为工作液；

4. 每个样本上滴加50μL上述 Proteinase  K工作液，使其被全部覆盖，37℃孵育 20min;

5. 用PBS溶液浸润清洗样本3次，每次3min  (处理后的样本放在湿盒中保持样本的 湿润)。

B.组织冰冻切片

1.将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS) 中固定，室温下孵育10-15min; 

2.片子从固定液中取出后，通风橱中自然晾干；

3.将玻片放入纯水或PBS 中润洗，去掉玻片上残存的固定液；

4.用组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔2-3mm   的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

5.配制Proteinase    K工作液：按1:99的比例，PBS作为稀释液来稀释ProteinaseK作为工作液；

6.每个样本上滴加50μL上述Proteinase  K工作液，使其被全部覆盖，37℃孵育10min;

7.用PBS 溶液浸润清洗样本3 次，每次3min (处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿 润 ) 。

C.细胞爬片

1.在Lab-Tek 载玻片小室 (Chamber   Slides) 上培养贴壁细胞，在凋亡诱导处理之后，用PBS轻轻润洗3遍载玻片；

2.向每个载玻片小室中加入适量的4%多聚甲醛溶液(溶于 PBS)  固定，室温下孵育20min;

3.去掉固定液，加入PBS 清洗3次，每次3min;

4.每个样本浸于破膜液中，室温孵育5min  进 行 通 透 处 理 ( 注 意 ： 推 荐 用Proteinase K工作液消化，37℃处理10min 左右，视细胞状态调整。若细胞易掉片则建议选择用破膜液处理);

5.在盛有PBS 溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

6.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

D.细胞涂片

1.以约2×107个细胞/mL  的浓度将细胞重悬于PBS 中，吸取50-100μL细胞悬液滴于防脱玻片上，使用一片洁净的载玻片轻柔涂开细胞悬液；

2.将玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定细胞，在4℃放置25min;

3.将玻片浸入PBS中，室温放置5min  浸洗，重复一次；

4.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体，用组化笔沿

着细胞外围轮廓画一个小圈，便于下游透性处理和平衡标记操作，在实验过程中，切勿让样品干燥；

5.每个样本浸于破膜液中，室温孵育5 min 进行通透处理(注意：推荐用2-20 μ g/mL 的 Proteinase K工作液消化，37℃处理10 min 左右，视细胞状态调整。若细胞

易掉片则建议选择用破膜液处理);

6.在盛有 PBS 溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

7.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体，处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

二 、标记与检测

1.平衡：5 x    Equilibration    Buffer稀释到1X,   每个样本滴加50  μL     EquilibrationBuffer 使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10 min(此步骤可以省略)；

2.标记液配制：按照比例配制Tunel 孵育液；

3.标记：尽量去掉平衡的 Equilibration Buffer,然后在每份组织样本上加入50 μLTdT 孵育缓冲液，在37℃孵育2-3 h;   注意不能干片，载玻片要避光；

4.立即用 PBS 润洗组织样本，清洗3次，每次5 min;

5.用滤纸轻轻擦掉样本周围的 PBS 溶液；

6.核染色：在每份组织样本上加入50 μL  DAPI,室温孵育1-3 min;

7.封片：样本染色完成后，用 PBS 清洗组织样本3 次，每次5 min, 然后轻轻去掉多余液体，封片；

8.镜检：立即在荧光显微镜下分析样本，载玻片注意避光， DAPI  能将凋亡和未凋亡的细胞核着色。

试剂组

实验流程简图

结果说明：

凋亡的细胞染色体断裂是渐进的。染色体DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解成较大的片段，之后部分染色体DNA 在 Ca²+和 Mg²+ 依赖的核酸内切酶作用下，在

核小体单位之间被随机切断，形成较小片段的核小体DNA 多聚体。因此在细胞凋亡晚期 ，DNA 会被降解成更小的片段，断裂的基因组DNA 上暴露出大量的3'-OH 末端，更容易被TDT酶复合物检测。因此凋亡早期绿光信号较弱，细胞核也相对完整，凋亡信号与细胞核基本重合。细胞凋亡晚期， DNA 会被降解成较小的片段，DAPI 着色较浅或者近

乎没有，此时也暴露大量3'-OH末端，结合更多的TDT绿光信号复合物，所以到晚期可能出现，只有很强的绿光信号， DAPI光很弱或者没有的结果。正常的心、肝、肺、肾、脑等组织一般没有明显凋亡信号，如做了其他处理诱导组织发生凋亡则会出现大量凋亡信。  (如心梗处、脑梗处凋亡信号会很明显肿瘤的坏死处表达也会很强)

注意事项：

1.蛋白酶K处理时间不能过久(植物，细胞一般5min 动物组织20min),  否则会导致细胞核受损染不上DAPI,  处理时间太短会导致tunel  信号不明显或无法标记完整。

2.蛋白酶k处理后需要反复冲洗干净，避免出现绿光片状不均匀的影响表达的观察。

3.试剂盒使用后及时放回常用保存温度，避免影响效价。

4.孵育温度保持稳定，孵育完冲洗干净，避免结果不均匀。